Придобитият имунитет - антитела синтез - основите на имунологията

Откриване и количествено определяне на клетки, образуващи антитяло

имунофлуоресценция

Клетките в цитоплазмата, които съдържат антитела могат да бъдат идентифицирани чрез "сандвич" (вж. Фиг. 5.20, д). Например, ако клетките, произвеждащи антитела с тетаничен токсоид, предварително обработен антиген и след това с флуоресцеин-белязани антитела токсоид, те лесно се открива чрез флуоресцентен микроскоп.

Методът на местната хемолиза

Най-често използваната локална хемолиза bezgelevy изпълнение, която е модификация на метода, предложен от първата Jerne и Nordin. Тази модификация се състои в това, че животински клетки, имунизирани с овчи еритроцити се суспендират заедно с излишък от еритроцити и на комплемента в тесния камера, образувана от две стъкла. По време на инкубирането, клетките, произвеждащи антитела, които секретират им имуноглобулин, който се свързва към околните еритроцити. Комплемента причинява лизис на еритроцити и около всяка клетка, продуцираща антитяло така наречения "директен" хемолиза зона, свободна от еритроцити (фиг. 7.1). Описаната техника е предназначена предимно за откриване на производство на IgM, тъй като тези антитела имат висока хемолитична активност. За идентифициране на клетките, синтезиращи IgG, това трябва да се добави IgG заешки антисерум. Комплекси антиглобулинови и еритроцитни антитела активират комплемента и да предизвикат образуването на така наречените "косвени" зони на хемолиза.

Фиг. 7.1. Jerne метод за местно хемолиза в модификация Cunningham за откриване на клетки, образуващи антитела, както и. Показва директен метод за преброяване на клетки, синтезиращи IgM. Индиректен метод за определяне на клетки, произвеждащи IgG, той изисква добавяне антиглобулиновия реактивна система. Разликата между броя на зоните, получени чрез директни и индиректни методи съответства на броя на клетките, които IgG. Обратните метод позволява всички клетки, произвеждащи Ig, в свързването на Ig секретира от еритроцити заредени антиглобулиновия реагент. Модификация на метода на местно хемолиза, което осигурява използването на мулти-ямкови плочи, може едновременно да се тества множество проби. б. Снимка на местните хемолиза зони в тъмната област. Те изглеждат като закръглен тъмните зони (някои от които са отбелязани със стрелки). Разликите в размера на хемолиза зони са разликите в афинитета на антитела и тяхната скорост на отделяне. (Разрешение н С Shapland жа R. Hutchings и д-р Г. Мъж).

Фиг. 7.2. Схематично представяне на метода "Elispot" (името идва от английски език. EL1SA) за преброяване на клетки, образуващи антитела. Картината показва част на панела, при ямки адсорбиран антиген (тиреоглобулин). Видими петна, отговарящи местоположение хибридомни клетки, синтезиращи автоантитела към тиреоглобулин. Клетките се откриват, използвайки антиглобулиновия реагент, конюгиран с алкална фосфатаза (предоставена от R. Hutchings). Горната и долната лява дупка две прави различни (последователно увеличаване) броя на хибридомни клетки, както се преценява чрез увеличаване на броя на петна в съответните ямки. В долния десен отвор е контрол. Той се добавя към хибридомни клетки различна специфичност.

Тази методология е приложим също и за откриване на клетки, които антитяло от различни подкласове има достатъчно izotipspetsificheskuyu заешки антисерум. местно метод хемолиза може да се използва по-широко, ако зареден еритроцити антиген, например пневмококова полизахаридна или зашит към повърхността на еритроцити хаптен групи.
Модификация "Elispot" е, че суспензията на клетките, които са антитела се инкубира с имобилизирания антиген на плаката. Локално секретирани антитела се свързват с антигена и след отстраняване на клетки, открити с помощта на пероксидаза-белязани антитела към IgG. след Цветната реакция се извършва чрез изливане на дъното на основата на чаша разтваря в гела. Ограниченият дифузията на оцветен реакционен продукт в гела води до появата на макроскопични петна, които лесно да се изчисли (фиг. 7.2).

протеиновия синтез

При образуването на антитялото в клетката е бърз метаболизъм на леки вериги, се откриват в цитоплазмата в малък излишък. Много миелом контрол клетъчно сливане е счупен, и може да има прекомерно производство на леки вериги, или дори пълно спиране на синтеза на тежките вериги. Дисулфидни моста между вериги могат да бъдат образувани по време, когато тежките вериги са свързани с рибозоми (фиг. 7,3), но последователността на образуване на междинни продукти зависи от естеството на имуноглобулин. Използване на етикетиране импулс с радиоактивни аминокиселини определя, че всяка лека и тежка верига се синтезират като цяло полипептид, като се излиза от N-края, и не сглобен от отделни пептиди. Освен това, дължината на всяка иРНК верига може да се синтезира целия полипептид цялост. Тези данни потвърждават гледна точка на сега се приема, че генетични фрагменти, кодиращи променливите и постоянните участъци на имуноглобулини са групирани заедно в хода на иРНК снаждане в ядрото на друг.
Наличието на алтернативен сплайсинг може да обясни коекспресията на повърхност IgD и IgM с идентични V региони (фиг. 7.4) и превключване синтез в секреторния IgM рецептор (Фиг. 7.5) в антитяло-продуциращи клетки.

Превключване класове слят имуноглобулинови срещат в отделните В клетки

Кинетика на синтеза на имуноглобулини, принадлежащи към различни класове, различни. Ако се въвежда антигена за първи път, е така наречената първична реакция. На първо място може да се намери IgM-продуциращи клетки, броят на които след това бързо намалява. Синтез на IgG достига максимум след дълъг интервал от време. Това е приблизително същото, както по време на първоначалното въвеждане на вторични антиген кинетиката на IgM. Въпреки това, в този случай, концентрацията на IgG в серума се повишава бързо до много по-високи стойности, и след това пада относително бавно (фиг. 7.6).

Фиг. 7.3. Синтез на миши IgG2a. Когато синтезата е завършена Н-вериги, съседни полипептидни вериги могат спонтанно свързват техните константни области. Смята се, че отделянето на тежки вериги синтезирани на рибозоми насърчава придържане леки вериги за образуване на молекула на L-Н-Н. Съединение с втората лека верига води до образуването на цялата имуноглобулинова молекула L-H-H-L (в Askonas VA Williamson A.R. (1986). Biochem.J. 109, 637).
Последователността на образуването на дисулфидни мостове между веригите варира между различните имуноглобулини, и се определя от относителното съдържание на връзки, които могат да бъдат оценени от чувствителност към редуктор. След образуването на повърхностен имуноглобулин рецептор е включен чрез хидрофобни последователности в мембраната на ендоплазмения ретикулум.

Фиг. 7.4. Повърхностно мембрана IgM- и IgG-рецептори са същата специфичност може да се изрази в една и съща клетка като резултат от алтернативен сплайсинг на първичния транскрипт трудно подредени. За простота, последователността лидер не е показано. Вълнообразните линии представляват интрони.

Фиг. 7.5. снаждане механизъм осигурява превключване синтез на мембрана секретираната форма на IgM. В секретиран хидрофобен последователност IgM, кодиран от екзони М--IgM и анкери рецептора в мембраната се нарязва (водеща последователност не е показан за простота).

Приблизително същата с IgA, т.е. имуноглобулини тези класове осигуряват бързо елиминиране повторно въведени антиген.
Има доказателства, че отделните клетки могат да преминат от производство на IgM на IgG. Няколко дни след имунизация с Salmonella камшичета антитяло продуциращи клетки, изолирани са поставени в култура течни капчици синтезирани антитяло имобилизиране бактерии като IgM, IgG и едновременно.

Фиг. 7.6. Dynamics Синтез IgM и IgG в първичен и вторичен хуморален отговор към антиген.
В друг хартия е показано, че въвеждането на антиген в облъчени реципиентите далаци адаптивно имунизирани с относително малък брой лимфоидни клетки, клетъчни колонии възникват едновременно синтезират антитела с различна тежка верига изотип но идиотип. Последното означава, че всяка колония произтичат от един прогениторни клетки, чието потомство може да синтезира антитела от различни класове.
Синтез антитяло изотиповете почти всички Т-зависим: животните лишени от Т-клетки, много класове антитела значително подтиснати. Например, в мишки е вярно за IgGl, IgA, IgE и IgM частично. Подобрение на имунен отговор пълен адювант на Freund, който е емулсия на вода-в-масло, съдържаща антиген във водната фаза и убити Туберкулозните бацили в маслената фаза (стр. 207), вероятно отчасти се дължи на активирането на Т-клетките помощници, които стимулират синтеза на антитела към Т зависими антигени. Вследствие предположение, че реакцията на Т-независими антигени (например, пневмококова полизахаридна, стр. 111) не трябва да се амплифицира адювант на Freund, се потвърждава в практиката. Освен това, както е споменато по-горе, тези антигени предизвикват предимно IgM синтез за генериране на слабо имунологична памет по същия начин, както въведени Т-зависими антигени тимектомизиран новородени животни, т.е. лишени Т-клетки.

Фиг. 7.7. Изотипно превключване синтезират антитела с идентична специфичност (в случая на IgM към IgG) се осъществява чрез "рязане линия". Този процес включва специален превключване последователност (червени кръгчета). В резултат на междинните части на ДНК (# 956;, # 948; и # 947; 3) са загубени.

По този начин, най-малко при гризачи превключване синтез на синтеза на IgG IgM и други класове антитела възниква под контрола на Т-клетки, които очевидно се осъществява от разтворими фактори, като например # 947; фактор на диференциация на В клетки (с 116.). Последователността на гена VDJ се прехвърля # 956; # 948; на друг ген константна област, и в този процес важна роля играе "превключване сайтове" (фиг. 7.7). В резултат на това се образуват антитела на същата специфичност, но с различен изотип.