Изолиране и култивиране на вируса

Изолиране и идентифициране на причинителя - "златен стандарт" за диагностициране на вирусни инфекции.

Вирусите възпроизвеждат само в живите клетки и възстановяване на патогена в заразената клетъчната култура - един от основните методи за диагностика на вирусни инфекции. Тъй като повечето от инфлуенца вирус е различна тъканна специфичност и модел, тогава почти всеки вирус може да се избере подходящите клетъчни или тъканни култури, както и за създаване на стандартни условия на култивиране (наличие на клетки от същия тип). Virus умножение осигури чувствителни (позволяващи) клетки. Следователно, разпределението на неизвестно патоген се извършва замърсяване еднократно на клетъчни култури 3-4, като се предполага, че един от тях може да е толерантен. Клетъчните култури се приготвят чрез диспергиране на съответните органи и тъкани, но често използват фетални тъкани (хора и животни), или трансформирани туморни клетки. Когато се поставя върху плоска повърхност, съответстваща на клетъчните култури обикновено растат като монослой.

Основно триптинизира култура. Суспензиите се приготвят чрез хомогенизиране на клетките съответните тъкани предварително третирани с трипсин. Културите често представя смесен тип клетки и не са обект на повторен отглеждане. Жизнеспособността на тези култури е около 2-3 седмици.

Poluperevivaemye диплоидна клетъчна линия представя човешки и животински клетки. Културите подходящи за ограничен повторно диспергиране и увеличение (обикновено не повече от 20-30 пасажи), като същевременно се запази жизнеспособността без да претърпява спонтанна трансформация.

Непрекъснато клетъчна линия (heteroploid култура), представена с клетки, подложени на продължително култивиране и спонтанни трансформации. Културата способен на дисперсия и множество perevivaniyu. Работата с тях по-малко трудоемък в сравнение с препаратите от първични култури; трансплантируеми клетки са относително подобни в техните морфологични и стабилност свойства.

Не всички видове клетки са способни да растат като монослой, в някои случаи и поддържането на диференцирани клетки е възможно само културата на органи. Обикновено това суспендирана тъкан, която има специализирана функция, наричана още тъканни култури преживява.

Пилешки ембриони - почти съвършен модел за отглеждането на някои вируси (например, грипни и морбили). Затворена кухина на ембриона предотвратява навлизането на микроорганизми от външната страна, както и развитието на спонтанни вирусни инфекции. Ембрионите се използват за изолиране на първичния вирус от патологичен материал; за пренасяне и ги съхранява, както и да получат необходимите количества на вируса. Някои патогени (напр херпесни вируси) предизвикват характерни промени (тъй като е възможно да се открие заболяването). Инфекцията се извършва на Chorio-алантоична мембрана, околоплодната или алантоисно, или в жълтъчната торбичка.

Инфекция на Chorio-алантоична мембрана. Обикновено се използва 10-12-дневни ембриони. Яйцата се преглеждат при преминаваща светлина, маркирайте местоположението на въздушната възглавница и да изберете областта, без кръвоносни съдове. Внимателно се отстранява фрагмент обвивка, диарични външния кожух и обелени внимателно чрез натиск. След това направи дупка в края на въздушната възглавница. Когато засмукване през него Chorio-алантоична обвивка се обелва от външната обвивка. На изпитваното вещество се прилага към него, без бактерии и протозои (преминал през бактериален филтър и третирани бактерициди).

Инфекция на околоплодна кухина. Обикновено се използва 7-14-дневни ембриони, в които след пилинг Chorio-алантоична мембрана (см. По-горе) се простират отваряне дръжка форцепс околоплодна мембрана и изтеглени през-залепващи алантоична мембрана. След това се прилага в амниотичната кухина на изпитвания материал.

Инфекция в Аланто на незначителност. 10-дневни ембриони са заразени чрез отвори, направени в черупката и основните мембрани (вж. По-горе).

Инфекцията в жълтъчната торбичка. използвате 3

ембриони 8 дни, които имат на тази възраст жълтъчната торбичка заема почти цялата кухина на яйцето. Инфекцията се извършва през отвор, изработен в въздушната възглавница

Мониторинг и отчитане на резултатите. Като вирус-съдържащ материал, е възможно да се използва съдържанието на жълтъчната торбичка, амниотичната и алантоична течност или цяло ембриона нарязани заедно с околните тъкани на парчета. За идентифициране на характерните поражения на horion- разработване пилешки ембриони.

алантоична мембрана се отстранява и черупката на външната обвивка. След това мембраната се отстранява и се поставя в стерилна вода. побеждава характер проучване на тъмен фон.

Ако не е възможно да се изолират и идентифицират вируса ин витро чрез стандартни методи инфекциозен материал прилагани на животни, податливи на патогена, и след развитието на типичен инфекциозен процес се извършва повторна инфекция чувствителни клетъчни култури. Най-често се използват мишки, зайци и маймуни; да подчертае някои вируси (като коксаки вируси) зарази мишки-сукалчета. Поради високата цена и сложността на съдържание лабораторни животни почти универсално измества техните клетъчни култури. Въпреки това, животински модели са широко използвани за проучване на патогенезата и характеристиките на образуването на имунни отговори към вирусни инфекции.

Наличието и биологичната активност на вируса се определя от наблюдаваните ефекти в животински модели (повишена телесна температура, появата на характерни клинични признаци, смъртни случаи, и т.н.), кокоши яйца, и върху клетките (в културите). Под влиянието на специфични вируси е възможно да се промени морфологията, растежа, възпроизводството на клетките, или тяхното унищожаване. размножаване на вируса в действителност чувствителни клетки ин витро се определя чрез цитопатични ефекти (включително плака, включени тела) gemadsorbtsii феномен на "цветна реакция."

Цитопатни ефекти се оценяват чрез микроскопия клетъчни култури. По степен на увреждане на клетките е изолиран вируси с високо или средно цитопатичен. вирусна репликация в клетъчни култури се придружава от нарушения на морфологията на монослойни клетки. Някои вируси причиняват характерни цитопатичните промени, които (като се вземат предвид клиничната картина) ви позволява бързо да направи предварителна диагноза. Например, умножение на парамиксовируси (вируса на морбили, заушка, PC-вирус) е съпроводено от появата на характерните многоядрени гигантски клетки; Аденовирусите предизвика образуването на големи кластери от кръгли клетки, и в размножаването на клетките херпесвирус кръгла форма дифузно разположени през монослоя.

Плака. "Плаки" се наричат ​​отрицателни колонии - парцели разкъсани клетки, които приличат на осветяване площ на монослой клетка покрита със слой от агар. В някои случаи, дозата и цитопатогенен вирус експресира в плака-образуващи единици (PFU).

Телата на включване. Много вируси причиняват инфектираните клетки, включени в характерни образувания - натрупване на вирусни протеини или частици, които са видими в светлинен микроскоп. Включените тела могат да бъдат разположени в цитоплазмата (Guarneri телешки с едра шарка) и в клетъчните ядра (аденовируси).

Липсата на CPE. Някои вируси (например вируса на рубеола) не показват цитопатичен ефект. Те могат да бъдат определени от намесата на друг вирус известно, че причиняват дегенерация на инфектираните клетки.

Феномен gemadsorbtsii. Много вируси, заразени клетки придобиват способността да се адсорбира на повърхността различни червени кръвни клетки. Явлението има gemadsorbtsii общи механизми с хемаглутинационен и се проявява в ранните етапи, преди началото на цитопатичния ефект, при липса или слаб израз на.

"Цветна реакция". Хранителната среда се използва за поддържане на клетките, което индикатора. Клетъчният растеж се придружава от натрупване на метаболити, промяна на рН и индикатор за промяна на цвета. Инфекция с вируса култури силно инхибира клетъчния метаболизъм и средата запазва първоначалния си цвят.

Rapid диагноза. За бързото идентифициране на вирусна инфекция разработени множество методи за бърза диагностика, базирани на откриване на вирусен Ag. Например, за ранна диагностика на HIV инфекция е широко използван ELISA, който открива повърхностен Аг вирус.