Идентификация (дисплей) вирус откриване на вируса в кокоши ембриони
Идентификация (дисплей) вируси
Откриване на вируса в кокоши ембриони
2.Poyavlenie миризма при аутопсия
3.Pomutnenie флуид в кухината
4. образуването на язви и кървене на черупките
Биологичната метода на изследването е инфекция на вируса е чувствителен към тест животински материал, изследването на патология и клинична картина на заболяването. При този метод, различни животни: маймуни, зайци, морски свинчета, кучета, мишки, плъхове. начини на заразяване: субдурален, вътремозъчен, назално и други.
Методи за откриване на вируса в организма на лабораторни животни, се различават в зависимост от вида на животните и тип вирус.
Откриване на вируси в клетъчна култура
Идентификация на цитопатичния ефект (CPE). CPE е на дегенеративни промени в клетките, които са в резултат на размножаването на вируса.
Разграничаване пълна и частична дегенерация на клетъчния монослой.
При пълно дегенерация, причинени от, например, полио вирус, Coxsackie и ECHO, монослой от клетки претърпяват значителни промени, повече от тях са експандиран от стъклото. Останалите единични клетки набръчкани
Частичен дегенерация има няколко разновидности:
Стил grozdeobrazovaniya (аденовируси);
По вид на фокусното унищожение (едра шарка, грип);
3.Po simplastoobrazovaniya тип (морбили, заушка, парагрип, херпес, СПИН).
Пролиферативна тип промяна е характерно за някои онкогенен вирус, трансформира в злокачествени клетки.
. Вътреклетъчните включвания, образувани в размножаването на някои вируси в цитоплазмата и ядрото на клетки (едра шарка, бяс, грип, херпес, и т.н.) Те проявяват под микроскоп след оцветяване монослой с Романовски - Giemsa, както и флуоресцентна микроскопия.
Цвят проба Салк. В резултат на клетъчната активност в културална среда да се натрупват кисели храни. В резултат, цветът на който е част от индикатор среда (фенол червено) става оранжева. При инфекция, на клетъчната култура цитопатни вируси като ентеровируси и реовируси, клетъчния метаболизъм се потиска и рН на средата не променя цвета си (червено среда остава).
Хемаглутинацията. В основата на тази реакция е способността на вируси, съдържащи хемаглутинин-рецептори "лепило" еритроцити. Ако има хемаглутинин - RGA + (чадър), ако не - RGA - (бутони).
Реакционните gemadsorbtsii. Механизмът на действие е подобен на DSA.
1. За целите на микробиологична диагностика на вирусни инфекции следната основна методологичния подход
А) бактериологично диагностика;
б) вирусологични диагностика;
в) серологична диагностика;
г) молекулно-биологични диагностика.
2. Вирусите се размножават само:
а) в живите системи;
б) върху обикновена агар;
в) на диференциално-диагностичен медии;
г) в среда на селекция.
3. Първият етап на вирусологичен диагноза е да се получи и да се подготвят
а) клетъчни култури;
б) пилешки ембриони;
в) чувствителни лабораторни животни;
г) диференциално-диагностичен среда.
4. Определяне на вируси:
А) чрез цитопатичен ефект;
б) върху образуването на плаки;
VPO цвят проба;
ж) Чрез биохимични свойства.
5. Откриване на вируса в кокоши ембриони
А) да променят хориоалантоинова мембрана;
б) RGA (аглутинация);
в RNC (допълни реакция фиксиране);
г) RP (реакция утаяване).
6. Какво е бактериофагите?
в) фагоцитни клетки;
7. Какъв микроби не разполагат с клетъчна структура?
8. Какво съдържа вируса е трудно да се организира?
а) два вида нуклеинова киселина;
б) един вид на нуклеинова киселина (или ДНК или РНК);
9. Вирусите отворена:
10. извънклетъчната форма на съществуването на вируси
г) елементарни тела.
Практическа работа № 9
Тема: Основи genetiki.Molekulyarno-биологичен метод за диагностика. Полимеразна верижна реакция и неговите варианти.
1. За да се проучи методите за предаване на генетична информация между бактерии:
трансдукция, трансформация и конюгиране.
2. Научете основните положения в биотехнологиите и генното инженерство.
Студентът трябва да знаете:
1. Формите на микробен вариант.
2. Условията за възникване на променливост на микроорганизми, тяхното практическо значение.
3. Същността на биотехнологии, цели и задачи.
4. микроорганизми и процеси, използвани в медицинската биотехнология.
5. Използването на генното инженерство в областта на биотехнологиите.
6. генетична рекомбинация микроорганизми.
1.Uchest на трансформация опит.
2. Вземете под внимание резултатите от трансдукция експеримент.
3. Вземете под внимание резултатите от спрягането на експеримента.
1. Медицински биотехнологии.
2. генетична рекомбинация: трансдукция, конюгация, трансформация
3. Ролята на генетична рекомбинация в генното инженерство и медицински
4. Използване на плазмиди в генното инженерство изследвания.
5.Primenenie генетични и молекулярни биологични методи
диагностика на инфекциозни заболявания: PCR, метод на молекулни сонди.
6.Biopreparaty получен чрез генно инженерство (ваксина
моноклонални антитела, хормони и диагностични инструменти).
Самостоятелна работа на студентите
1.Uchet експериментални резултати на трансформация.
2. За да се вземе предвид опитът трансдукция.
3. За да се вземе предвид опита на свързване.
4.Ukazat верни отговори в тестовете.
Информационни материали ДЕЙНОСТИ
Постановка опит на трансформация
Получател - щам BacillussubtilisStr (сенна бацил, чувствителни към стрептомицин); донор - ДНК се изолира от щам V.SubtilisStr (стрептомицин устойчив). Селективна среда за подбор на рекомбинация Нан (трансформанти) хранителен агар, съдържащ 100 U / мл стрептомицин.
Към 1 мл Б. субтилис бульон културата се прибавя 1 мг / мл DNase разтвор в 0,5 мл разтвор на магнезиев хлорид, за да наруши ДНК не прониква в бактериални клетки реципиент щам и се инкубират в продължение на 5 минути. За да се определи броят на рекомбинанти образувани стрептомицин (трансформанти) Смес от 0,1 мл неразреден се посяват върху селективна среда в петриево блюдо. За да се определи броят на получател клетъчни култури в изотоничен разтвор на натриев хлорид получава 10-кратни разреждания от 10 -5 -10 -6 (за се преброява броя на колониите), посяват с 0,1 мл стрептомицин без хранителен агар, и за контролиране - от агар стрептомицин. Най-сетне среда получател култура не трябва да расте, тъй като тя е чувствителна към стрептомицин. Засяване се инкубира при 37 0 С следващия ден, експерименталните резултати взети предвид, и определяне на честотата трансформация относителните количества отглеждат рекомбинантни клетки сред клетките на щам получател.
Да приемем, че когато посев 0.1 мл култура retsipi-entnogo щам при разреждане на 10 -5 170 колонии нарастват, и когато посев 0,1 мл неразреден сместа - 68 колонии от рекомбинантен щам. От всяка колония се образува в резултат на възпроизвеждане само на една бактериална клетка в 0.1 мл получател култура инокулира съдържа 170 х 10 май жизнеспособни клетки и 1 мл - 170 х 10 6 или 1.7 х 10 8. В същото 68 е времето на рекомбинантни клетки в 0,1 мл и 1 мл - 680, или 6.8 х 10 на февруари.
Следователно, честотата на трансформация в този експеримент ще бъде равен на:
Постановка опит специфичен трансдукция
Получател - щам Е.коли лак -. лишени от 3-галактозидаза оперон контролиране на ферментацията на лактоза. Трансдукция фаг -. Фаг X dgal, в които част от гена геном заместен (3-галактозидаза оператор, Рон Е. Coli е дефектна, че не е в състояние да предизвика продуктивна инфекция прекратяване лизис на E.coli, и е означен с г (фаг dgal .. ) с името съдържа в генома на оперон гал среда избор бактериална -. сряда Ендо на която laktozootritsatelnye получатели щам бактерии образуват безцветни колонии и колонии от рекомбинантен щам съдържание на лактоза стане червено с метален нюанс . Към 1 мл от 3 часа бульон култура на щама получател, 1 мл трансдукция фаг dgal концентрация 10 6 -. 10 юли частици в 1 мл сместа се инкубира за 60 минути при 37 0 С, след получаване на серия от 10-кратни разреждания (в в зависимост от очакваната концентрация на бактерии) до получаване се преброява броя на колониите. от тръби разреждане 10 -6 изработка посяване 0.1 мл култура на 3 петриеви панички с Ендо среда и течността с шпатула върху среда повърхност е равномерно разпределена.
Културите се инкубират в продължение на 1 ден, след което точка на експериментални резултати и изчислява относителната трансдукция броя честота клетка на рекомбинанти (транс duktantov) е включен във всички плочи, между реципиент щам клетка.
Например, след инокулация с 0.1 мл от смесения култура при разреждане на 10 -6 до 3 чаши с Ендо среда увеличени, съответно 138, 170 и 160 на безцветни колонии от щама получател в първите и последните плочи - 5 и един червени колонии трансдуктантите. Следователно, честотата на трансдукция след това се равнява на:
Формулировка опит конюгиране за прехвърляне на хромозома фрагмент, който съдържа genleu контролиране на синтезата на левцин.
Донор - щам Е.коли К12 HFR Leu ул S; Получател - щам Е.коли К12 F - Leu + ул R. HFR - наименование положение, което е характерно за висока честота рекомбинация. Селективна среда за изолиране на рекомбинанти glyukozosolevaya минимална среда: КН 2РО 4 - 6.5 гр, MgSO 4 - 0,1 г, (NH4) 2SO4 - 1 г, Са (NO3) 2 - 0.001 грама, FeSO4 - 0,0005 грама глюкоза - 2 г стрептомицин - 200 U / мл дестилирана вода - 1 литър.
Към 2 мл 3-часова култура, 1 мл получател културален бульон донор. Културите се инкубират при 37 0 ° С в продължение на 30 минути. Сместа след това се разрежда до 10 -10 -2 3, и се посява върху 0,1 мл селективна агарна среда в Петриева паничка върху които растат само колонии рекомбинанти. Като контроли на същата среда се посяват донор и реципиент щамове, които не растат в него, К. Първата щам чувствителни към стрептомицин т.е.., А другият е ауксотрофен за левцин. Освен това, култура на щама на донор се посяват върху селективна среда без стрептомицин и култура на щама получател - на пълна среда (хранителен агар) с антибиотик за определяне на броя на жизнеспособните клетки. Културите се инкубират при 37 0 ° С до следващия ден. След преброяване на броя на колониите се определя рекомбинация честоти относителните количества от рекомбинантни клетки на реципиента.
Например, след посяването 0.1 мл донор и реципиент култури в разреждане от 150 колонии отгледани рекомбинанти 10 -2 и след засяването 0.1 мл получател култура разреждане 10 -6 75 колонии. По този начин, честотата на рекомбинация е равна на:
Полимеразна верижна реакция (PCR) - един от съвременни молекулярно-генетични техники, основан на принципа на повторно копиране (усилване) на определен регион на ДНК или РНК. В този процес, количеството на ДНК в пробата се определя чрез увеличение на десетки милиони пъти, което прави възможно последващо откриване на амплифицираната ДНК. Така PCR разкрива незначителни ДНК фрагменти, специфични за определен вид бактерии, и по-точно идентифициране на този вид.
PCR в клетката е била открита преди повече от 30 години, нобелови лауреати и A.Kronbergom D.Ledebergom. Принципът на PCR ин витро метод е разработен K.Myulisom през 1983 г., също става Нобелова лауреат. Почти веднага имаше съобщения за неговото практическо приложение. Въпреки това, по време на този период поради липса на необходимото оборудване PCR се извършва чрез ръчно тръби трансфер в термостат при желаната температура. Задължително за синтеза на ДНК ДНК полимераза ензим унищожени след всеки етап на денатурация (95 ° С), но той изисква непрекъснато добавяне на нови порции.
В 1988 грама се получава термостабилна ДНК полимераза от бактерия Thermophilus aquaticus, живеещи в горещи извори. Разработени са специални устройства за усилване (Thermocycler). Създаден модерна лазерна технология секвениране (декодиране ДНК нуклеотидни последователности). Това доведе до факта, че PCR станаха достъпни за широко използване в лабораторна практика.